为什么有的基因定位结果与预想的不一致？
对于一个特定的定位载体，只要荧光表达较好，其定位结果是确定的，不会随人为意愿或操作而改变。至于有时候和预想的结果不一样，可能和蛋白本身、选择的表达载体以及荧光蛋白融合方式等有关。
为什么有的普通定位结果出来后无法准确判断其定位位置？
细胞中的细胞器复杂且多样，除一些常见的、特征比较明显的细胞器外，有些细胞器在激光共聚焦下形状比较相似，例如：线粒体、过氧化物酶体、高尔基体等细胞器，它们的荧光表达形状可能都是点状，因此不易区分。这时可以结合基因的其他功能研究来判断其可能表达的位置。另外，蛋白表达本身也是一个复杂的过程，涉及到多个合成场所及转运过程，自身表达情况可能比较复杂，因此不易判断具体的表达位置。
除了洋葱亚细胞定位，还有许多其他亚细胞定位方法。其中，比较常见的有：
荧光法：将学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。用荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等也称为荧光细胞(或组织)化学技术。
GFP融合蛋白表达法：将目的蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达位置。
亚细胞结构分离定位法。
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